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Servicio: SERVICIO DE BIOLOGíA FUNDAMENTAL

Unidad: INFORMACION GENETICA [ING]
Fuentenueva. Sede Central

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EQUIPO: Secuenciador 3130 Genetic Analyzer (4 capilares)Applied Biosystems (Hitachi)

Requisistos de las muestras a secuenciar:

Se pueden secuenciar tanto fragmentos clonados en plásmidos convencionales como fragmentos amplificados por PCR. Los primeros se deben suministrar a una concentración entre 100 y 200 ng/µl(nanogramos/microl) y un volumen total de entre 15 y 20µl, y la muestra se ha de purificar convenientemente en columna ( no con fenol). Con respecto a los fragmentos de ADN amplificados por PCR (no clonados), la muestra se debe suministrar a una concentración aproximada de 20ng/µl para fragmentos de hasta 700pb y de 40ng/µl para fragmentos mayores e igualmente se deben purificar con Kits comerciales( no con fenol); además en este caso se deben suministrar los primers utilizados para la amplificación, a una concentración entre 10 y 5 µM(micromolar) y un volumen total de entre 5 y 10µl. También debéis rotular cada muestra y traer número de petición.

Cuando el usuario traiga la muestra con la reacción de secuenciación y precipitación hecha, para meter directamente en el secuenciador, en el caso de que requiera una repetición correrá de su cuenta.

Registro de Entrada de Muestras del Secuenciador 3130 - Genetic

Registro de Identificación de Muestras 3130 - Genetic a rellenar por el usuario que traigan 1/2 placla o 1 placa para analizar fragmentos; NanoQuant modelo Infinite M200 Pro; Secuenciador masivo MiSeq-Illumina

El CIC dispone de un secuenciador MiSeq de Illumina para realizar experimentos de secuenciación masiva, basada en la secuenciación por síntesis de la muestra. Este equipo , permite secuenciar lecturas de: 50, 75, 150, 250 aproximadamente hasta 300pb, pudiendo producir hasta 30 millones de lecturas en pair-end, (leer las dos cadenas de DNA), generando hasta 7giga-bases de secuencia.
El kit Nextera-XT permite secuenciar ADN: de novo, resecuenciar genomas pequeños, metagenómica(16S). En ellos se necesita la preparación una librería de la muestra, en la cual se incorporaran los adaptadores (index) para poder secuenciarlos en el MiSeq. La calidad de esta librería se evaluara en el Tape Station 2200 de Agilent.

Equipos auxiliares:
     Tape Station 2200 Agilent
     Termociclador qTOWER 2.2 Analitykjena
     NanoQuant Infinite 200 PRO Tecan

Normas de uso Secuenciación Masiva MiSeq

Formato Genoma de Referencia MiSeq

Adjunto Formación Librerías y Tipo Cartridge MiSeq

Técnicas: Secuenciación de ADN: Clonado de plásmidos, productos de PCR.; Análisis de Fragmentos; Lectura de placas; Medición de muestras; PCR T. Real; Secuenciación masiva: MiSeq-Illumina

Aplicaciones: Secuenciacion de ADN.; Análisis de variabilidad genética

MiSeq; DNA-seq: Secuenciación de Novo, Resequencing; Metagenómica: identificación de microorganismos presentes en la muestra(estudio taxonómico…); Amplicones: Multiplexación (secuenciación simultanea de muchas muestras añadiendo a cada amplicón una etiqueta para identificarlas)